PCR技术

2021-04-15 16:06:34 17

1985年关于PCR 的文章由美国科学家Kary Mullis等人在 《Science》杂志上发表 。

1989年《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶(生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 )的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为个“年度分子”。

1993年Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。

PCR技术的原理 

  遗传物质由细胞核、染色体、DNA(脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)、碱基(A、T、C、G)是按双链螺旋排列的,碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。比如人类体细胞有31亿个碱基对,按上述的0.1%的差,人和人之间有3百万个碱基对的差别。 

  PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。

  PCR反应的基本成分包括7种基本成分:模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。基本反应步骤 :变性--退火--延伸。通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出。

PCR技术的注意事项

1、防止污染,建立良好的质量控制。操作时避免气溶胶产生,特别注意阳性样品的拿放,使用一次性耗材,穿戴手套并经常更换,永远在一步才加核酸,液体分装使用等。

2、引物设计合理。

3、Taq酶扩增错误率较高,大约1/100对碱基/20个循环。

4、镁离子浓度对反应效率的影响。

5、仪器稳定性,升降温速率,管子的密合度等。

6、RT-PCR注意防止RNA降解。